基于体外细胞和模型的化妆品美白功效评价

本文要点：利用黑素细胞体外培养 、共培养技术以及三维皮肤模型对化妆品的美白功效进行评价。

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黑素瘤细胞

早期多采用黑素瘤细胞模型进行实验，如小鼠黑色素瘤B16细胞和人表皮黑色素瘤A375细胞，小鼠B16细胞具有能够多次传代、生长快和对培养条件要求相对较低等优点，成为筛选美白活性成分的首选细胞。

缺点是与人体黑素细胞存在差异，而且经过几代反复培养后，其黑素产生能力会降低，需要在裸鼠体内重新成瘤后再次培养以获得高表达细胞。多用于美白活性成分的大规模或高通量筛选。

案例展示：大戟提取物的抗氧化和美白功效

（Antioxidant and skin-whitening effects of aerial part of Euphorbia supina Raf. Extract, 2018.）

(1) 功效评价的基础——细胞增殖和细胞毒性

细胞增殖和细胞毒性检测是化妆品功效评价的基础数据,也是选择功效原料添加安全浓度的必要手段。部分化学物质在某一浓度范围内对细胞无明显毒性作用,但超过安全浓度时,一般情况下会随着物质浓度的增加使毒性增大,导致细胞存活率下降。

进行活性物质筛选、安全浓度选择时,需根据功效评价的特定需求,对目标物质进行细胞毒性检测,通过检测细胞数量和观察细胞生长状态等指标间接反映该物质的细胞毒性。

图1 ES提取物对B16细胞活性的影响

用不同浓度的大戟（Euphorbia splendens，ES）提取物(8、40、200μg/mL)处理B16细胞24h，观察细胞生长情况，然后进行 MTT 比色法测定,结果显示ES提取物对 B16细胞无毒性作用(图1)，上述浓度可以继续进行下一阶段功效测试。

备注：α-促黑色素细胞激素(α-MSH)，是一种由13个氨基酸残基构成的神经内分泌激素，是黑素细胞刺激素中的一种。

(2) B16黑素合成和细胞内酪氨酸酶活性抑制测定

ES提取物对黑色素合成和胞内酪氨酸酶活具有显著的剂量依赖性抑制作用。黑色素含量以百分比表示。

图2 ES 提取物对B16黑色素含量与细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用

(3) ES 提取物对黑素合成相关蛋白表达的影响

用 WB方法检测B16细胞裂解液中酪氨酸酶和 MITF表达水平，结果表明用 α-MSH 刺激细胞，酪氨酸酶和 MITF表达明显增加。而ES提取物能抑制酪氨酸酶和 MITF 的表达，且呈剂量依赖性。

图3 ES 提取物对黑素合成相关蛋白表达的影响

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人表皮黑素细胞

(Human Epidemal Melanocytes，HEM)

从正常皮肤材料中原代培养获得，可用于美白活性成分的大规模筛选。HEM 在医学上被用作色素类疾病的药物体外筛选模型，目前也被用于美白剂的大规模筛选和细胞毒性评价。

图4 人表皮黑素细胞形态图（×200）(博溪生物)

该细胞具有正常的黑素合成能力，在UV等刺激条件下可上调黑素合成水平，可用于美白功效评估、黑素细胞相关研究及3D黑素皮肤模型的构建。基于人黑素细胞，可以进行黑素含量测定以及黑素合成相关基因的检测。

图5 黑素合成相关基因的表达(博溪生物)

备注：

α促黑素细胞激素(alpha—melanocyte_stim ulating hormone，α-MSH）

黑色素细胞表面黑皮质素受体1(Melanocortin_1 receptor，MClR)

小眼球相关转录因子(Microphthalmia associate transcription factor，MITF)

酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)，酪氨酸酶相关蛋白2(TRP 2)

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黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型

在体内， 1 个 MC 细胞(Melanocytes)可以接触并传递黑色素给 10 - 36 个 KC 细胞(Keratinocytes)。在体外，以经过优化的比例将两种细胞混合培养可构建“表皮黑素单元”模型，适用于研究黑素细胞与角质形成细胞间的相互作用和美白功效评价。

如永生化的人表皮角质形成细胞株 HaCaT 与人黑色素瘤 A375 细胞株共培养构建的 A375 - HaCaT 是最常见的“表皮黑素单元”体外培养模型 。

案例展示1：不同纯度高良姜素对共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响

（不同纯度高良姜素对 A375 - HaCaT 共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响 , 2014）

该课题组之前通过体内外药效筛选模型确定高良姜总黄酮对白癜风具有良好治疗作用。因此,本研究拟通过 Transwell小室建立 A375-HaCaT 共培养模型,研究不同纯度、不同浓度的高良姜素对共培养模型中的 A375 细胞增殖及黑素合成的影响,为高良姜治疗白癜风的新药研制及临床合理用药提供实验依据。

HaCaT 细胞正常贴壁培养后呈现多角形、团块状， A375 细胞呈梭形、双极、三极或多分支树突状。A375︰ HaCaT 以 1︰3 的比例通过 Transwell 小室共培 48 h 后，如图所示。

图6 体外正常培养的A375 和 HaCaT（×200）

研究显示高良姜素能够显著促进 A375-HaCaT 共培养体系中 A375细胞增殖,提高细胞中黑素含量及酪氨酸酶活性。其药物作用机制可能与 HaCaT 细胞中 ET-1 和 SCF 细胞因子的表达升高有关。

案例展示2：角质细胞摄取黑色素实验

黑色素生成后转运给角质细胞，角质细胞摄取黑色素，从而决定了皮肤的颜色。

通过抑制黑素从黑素细胞向角质细胞的转移也是对化妆品中美白功效添加剂进行评价的重要手段。黑素生成向胞内转移是黑色素细胞中黑色素体向突起末端迁移的结果 ，这个过程需要分布于树突微管上的微管发动蛋白推进完成 。因此 ，抑制黑色素细胞突起形成 、阻碍角质细胞对黑色素的摄取 、抑制角质细胞吞噬活性 、或直接影响 MITF抑制黑色素转移等手段都可以对美白添加剂功效进行评价和验证。

Ma等建立了人表皮黑素细胞和 HaCaT 角质形成细胞的共培养模型 ，用以评估黑素小体转移。流式细胞仪定量分析检测不同培养时间的黑素体转移，结果显示转移到 HaCaT 角质形成细胞的黑素小体（荧光斑数量；黄色）呈时间依赖性增加。

图7 基于黑素细胞-HaCaT 角质形成细胞共培养体系评价黑素小体从黑素细胞向角质形成细胞转移（ Hui-Jun Ma，2009 ）

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含黑色素的重建皮肤模型（3D黑素模型）

近年来 ，重组3D皮肤模型已成功用于皮肤刺激、光毒性和皮肤致敏的评价 ，也用于皮肤吸收和功效的检测 。

构建含黑素细胞的体外重建表皮模型，将黑素细胞整合到重建的人类表皮中，重现黑素细胞周围的三维结构，也是评估化妆品美白功效非常有效的体外研究工具。

图8 体外重组3D黑素模型MelaKutis®具有正常的黑素细胞分布结构（来自博溪生物）

3D皮肤模型在实验室环境下进行体外培养 ，相比较而言，与人体表皮具有更高的相似性，实验精度高、有很好的特异性和高灵敏度，重现性好，可以有效避免同源性差的细胞模型或动物实验因种间差异带来的实验结果偏差，已逐渐成为研究皮肤生物学和功能机制相关的体外模型。

案例展示

以3D黑素皮肤模型（MelaKutis®）（广东博溪生物科技有限公司生产）为测试工具，采用表面给药的方式，将样品模拟人体使用过程，均匀涂布于3D黑素皮肤模型表面，通过给药后模型表观照片、皮肤模型的亮度（L*值）、黑素含量等三个维度指标，评估不同样品组的体外美白功效。

图9 3D皮肤模型的给药方式（来自博溪生物）

测试方法及指标解读

将待测物直接涂布于具有屏障功能的模型表面 ，作用一段时间后 ，检测深层的黑色素细胞的变化 。

(1) 表观色度

通过拍照或者扫描观察实验组与阴性对照组模型表面黑素沉积的变化，可以更为直观的体现产品的美白效果。

(2) 黑素含量

黑素含量的多少是评价样品作用效果的最终指标，使用黑素标准品定量，绘制标准曲线图，通过吸光度值计算模型中黑素的含量。

(3) 表观亮度（L值）

Lab仪中的L值代表的是皮肤亮度的高低，L值范围从0到100，L值越大黑素模型越白，L值越小黑素模型越黑。在相同环境亮度条件下测得的皮肤模型的L值大小可评估产品的美白功效。

上述基于3D黑素模型建立的体外美白功效评价是一个综合、较为全面的评估方法，从上图可以看到，模型的表观色度可以作为产品美白功效测试的可视化的指标；黑素含量则是最终评价样品美白功效的指标；而L值代表明暗度（黑白），它的阈值是0-100，数值越高，说明皮肤越亮，越白。当然，基于3D黑素模型的组织学优势，还可以观察样品作用后模型中黑素变化和沉积情况。

体外评价方法及实验主要用于新型原料或者配方的评估 ，便于早期发现待评物质的效应，同时可了解其细胞毒性，进而减少研发进程中的盲目性和不必要性投入。因此，美白制剂的功效评价，需结合黑素形成与转运的机理，通过分子水平、细胞水平以及组织水平进行综合判定。

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